安徽省重点水域水生生物资源监测项目底栖动物样品采集分析与保存工作规程

底栖动物样品采集参照《长江水生生物资源监测手册》（中国农业出版社，2021年）、《内陆水域渔业自然资源调查手册》（农业出版社，1991年）、《河流水生生物调查指南》（科学出版社，2014年）、《生物多样性观测技术导则 淡水底栖大型无脊椎动物》（HJ710.8－2014），鉴定分析参照《淡水无脊椎动物系统分类、生物及生态学》（中国水利水电出版社，2015年）、《中国北方摇蚊幼虫》（中国言实出版社，2011年）等。

一、主要材料

1. 主要工具

底泥采泥器：抓斗式采泥器（开口面积为1/32 m²）、彼得森采泥器（开口面积为1/16 m²）、带网夹采泥器（开口面积为1/6 m²）。

索伯网：定量框规格为0.25 m×0.25 m，网目为60目。

D型网：直边长度约为0.3 m，网目为60目。

拖网：网目为60目。

分样筛：网目为60目。

尼龙筛绢：网目为60目。

样品瓶：广口样品瓶（50至1000 mL各型容量）。

载玻片：76 mm×26 mm，厚0.8 mm～1.2 mm。

矩形盖玻片：22 mm×22 mm，厚0.17 mm。

圆形盖玻片：ø6 mm，厚0.17 mm。

正置显微镜：物镜4×、10×、20×、40×、100×；目镜10×或15×，带摄影系统。

体视显微镜：物镜0.8×或1.0×，可调变倍比≥4:1，目镜10×或15×，带摄影系统。

电子天平：最大称量220 g，分度0.0001 g；最大称量500 g，分度值0.001 g；最大称量3000 g，分度值0.01 g。

吸管：1 mL，3 mL，5 mL，10 mL。

解剖器具：解剖针、圆头镊、眼科镊、长柄圆头镊等。

其他工具：地笼、白瓷盘、培养皿、自封袋、吸水纸、放大镜等。

2. 试剂

甲醛溶液：φ（HCHO）=37%～40%。

甲醛溶液：φ（HCHO）≈4%，量取37%～40%的甲醛溶液约10 mL，用水定容至100 mL。

无水乙醇：ρ（C₂H₅OH）=0.79 g/mL。

乙醇溶液：φ（C₂H₅OH）=75%。量取无水乙醇75 mL，用水定容至100 mL。

二、样品采集

1. 采样频次

繁殖期（4－7月）、索饵期（9－11月）各开展1次。

2. 非涉水水域（长江、支流、湖泊、水库等）底栖动物定量样品采集

每个采样点累计采样面积为1/8 m²。使用抓斗式采泥器（开口面积为1/32 m²）采集，每个采样点采集4次，或彼得森采泥器（开口面积为1/16 m²）每个采样点采集2次，采样厚度一般为10~15 cm。采集后泥样倒入尼龙筛绢内在水中摇荡筛洗，筛洗后的样品连同杂物全部装入自封袋中，贴上样品编码（写明采集地点、站位及样点编号、日期），放入保温箱中保存备用。

3. 可涉水水域（如溪流）底栖动物定量样品采集

每个采样点累计采样面积为1/8 m²。使用索伯网（定量框规格为0.25 m×0.25 m，网目60目）采集，每个采样点采2次；采样时，放置好定量框，将索伯网网口正对上游定量框，用脚或小铁扒有力地搅动索伯网前定量框内的底质，使样品连同部分底质随水流一起被冲进网内，并用手刷将粘附在石块上的螺类等洗刷入网，在水中摇荡筛洗，筛洗后的样品连同杂物全部装入自封袋中，贴上样品编码（写明采集地点、站位及样点编号、日期），放入保温箱中保存备用。

4. 底栖动物定性样品采集

在各类群的典型生境或特殊生境设置样点，如水中大型植物根部、倒木、水生植物的茎叶、溪流中或小河岸边的石块底部、石缝等处，弥补定量采集中遗漏的栖息在特殊生境的底栖动物类群。

①采泥器采样

对于非涉水水域使用抓斗式采泥器或彼得森采泥器在典型生境或特殊生境中采集定性样品，方法参照非涉水定量采集方法；在非涉水水域沿岸的可涉水区，若有螺、蚌等较大型无脊椎动物时，可使用带网夹泥器（开口面积1/6 m²）针对性采集。采集后样品放入自封袋中，贴上样品编码（写明采集地点、站位编号、日期），放入保温箱中保存备用。

②抄网采样

对于可涉水水域使用索伯网、D形网等在典型生境或特殊生境中采集定性样品，方法参照可涉水定量采集方法。在植被根株区域采样，将抄网放置于根株下游，踢击根株促使生物分离；在底质粗糙（混合砾石、卵石或大石块）生境采样，将抄网底部紧贴在底质上，踢击抄网上游0.5~1 m²范围内的底质，促使生物分离；或者将抄网的直边紧贴河流底部，向前拖动抄网，使样品随着搅动和流水的冲刷进入网内。使用抄网采集时，应注意使网的下半部分尽量撑开，将网的下沿尽量紧贴底质，网口稍向后倾斜。并注意不要使网的上沿进入水中。待流经网中的水变清后，再捞起抄网，将网内采集的样品全部装入自封袋中，贴上样品编码（写明采集地点、站位编号、日期），放入保温箱中保存备用。

③拖网采集

在水深小于2 m的湖泊或河流沿岸的浅水区，可使用拖网进行定性样品采集。采样时，将拖网（带有重锤）抛入水中，在船上缓慢拖行（船速5~10 km/h），至一定距离后提起拖网，将网内采集的样品全部装入自封袋中，贴上样品编码（写明采集地点、站位编号、日期），放入保温箱中保存备用。

④徒手采样

在可涉水水域，针对一些特殊的底栖动物类群如溪蟹类，可采用徒手采样法进行定性采样。一般选择在溪流上游或溪流源头人迹稀少、罕至的生境，采集时选择水流较缓慢且有较多石块的区域进入小溪或浅河，轻轻掀起水中石块，查看石块下方是否藏匿有底栖动物。一旦发现，迅速抓住、放入自封袋中，贴上样品编码（写明采集地点、站位编号、日期），放入保温箱中保存备用。

⑤地笼网采样

在浅水湖泊、河流等水流较缓的水域，可使用地笼网进行样品采集。所用地笼网的规格可视水面宽度和水深等做适当调整。布设地笼网时，先将地笼网两端网口扎紧，将一端绑在水中木桩或浮漂上，另一端（连接重物）抛入水中（必要时可先在地笼网内放入适量食料作为诱饵）。通常在傍晚前下网，次日清晨起网（若底栖动物密度较低，可放置数日）。起网后，将地笼网内采集的样品全部装入自封袋中，贴上样品编码（写明采集地点、站位编号、日期），放入保温箱中保存备用。

注：①每个站位于不同生境采集的定性样品混合为1份样品，标注该站位编号；②若气温较高或路途中放置的时间较长，则需将样品冷藏保存或在自封袋中加入适量的乙醇溶液（至终浓度70%左右），以防止样品腐烂。

5. 样品编码

定量样品编码方式采用“监测站位+采样点位（每个监测站位设置3个采样点位）+底栖动物定量（简称底栖定量）+采样年月日” （如站位1－1－底栖定量－2023/4/1，表示2023年4月1日采集1号站位1号采样点底栖动物定量样品）。

定性样品编码方式采用“监测站位+底栖动物定性（简称底栖定性）+采样年月日”（如1－底栖定性－2023/4/1，表示2023年4月1日采集1号监测站位底栖动物定性样品）。

三、样品预处理与固定

将带回的样品从自封袋倒入60目分样筛内，用自来水清洗，直至污泥完全洗净，再将洗净的样品倒入白瓷盘中，用圆头镊或眼科镊、解剖针、吸管拣选，拣出各类底栖动物，必要时需借助放大镜进行拣选。挑出的样品可放入广口样品瓶中，用75%乙醇溶液固定，固定24 h后，更换1次75%乙醇溶液以便长期保存，加入的固定液体积应以溶液完全没过动物样品为宜。

四、样品寄送

样品采集后需在5日内完成定性和定量样品送样，每个站位寄送底栖动物样品4瓶，分别为1瓶底栖动物定性样品（简称底栖定性）、3瓶底栖动物定量样品（简称底栖定量）。样品瓶应确保严格密封，同时发送寄样清单至鉴定人员，核对样品数量、样品编码等信息。寄样清单格式：

五、物种鉴定分析

1. 物种鉴定与计数

参考相关鉴定工具书（附录1）或在相关分类学家的指导下，对采得的样品在放大镜、体视显微镜和正置显微镜下进行形态分类和物种鉴别并计数，优势种应鉴定到种，其它若确实无法鉴定到种，可鉴定至上级分类单元。

2. 称重

先称各采样点总重，然后分类称重。小型种类，如蚯蚓、摇蚊幼虫等，放在吸水纸上轻轻翻动，吸去附着水分，然后至于分度值0.0001 g或分度值0.001 g的电子天平称重；大型种类，如螺、蚌等，可分度值0.01 g的电子天平称重，其数值为带壳鲜重，记录时应备注说明。称量工作结束后，所有标本应立即存放于广口样品瓶中妥善保存。

3. 分析记录

底栖动物定量和定性样品分析记录表格式，见附录2。

4. 密度和生物量计算

密度=数量/采泥器面积/采样次数

生物量=质量/采泥器面积/采样次数

六、样品保存

完成鉴定分析后的样品，加入甲醛溶液（在时间和条件允许的情况下，可参见附录3对各类底栖动物样品分别进行固定）固定，以溶液完全没过动物样品为宜，以期长期保存样品。所有样品鉴定完成后，需将样品送回中国水产科学研究院淡水渔业研究中心保存。

附录1

底栖动物分类检索依据

D.1 综合类：

a）王业耀等.中国流域常见水生生物图集[M].北京:科学出版社,2020.

b）大连水产学院.淡水生物学（上册）[M].北京:农业出版社,1982.

D.2 环节动物门：

a）王洪铸.中国小蚓类研究[M].北京:高等教育出版社,2002.

b）杨潼.中国动物志:环节动物门,蛭纲[M].北京:科学出版社,1996.

D.3 节肢动物门：

a）Morse J C, Yang L, Tian L. Aquatic insects of China useful for monitoring water quality[M]. Nanjing: Hohai University Press,1994.

b）李新正.中国动物志:无脊椎动物,甲壳动物亚门,十足目,长臂虾总科[M].北京:科 学出版社,2007.

c）梁象秋.中国动物志:无脊椎动物,甲壳动物亚门,十足目,匙指虾科[M].北京:科学出版社,2004.

d）任先秋.中国动物志:无脊椎动物,甲壳动物亚门,端足目,钩虾亚目[M].北京:科学 出版社,2006.

e）王俊才,王新华.中国北方摇蚊幼虫[M].北京:中国言实出版社,2011.

f）唐红渠.中国摇蚊科幼虫生物系统学研究（双翅目：摇蚊科）[D].南开大学,2012.

g）中国科学院.中国经济昆虫志[M].北京:科学出版社,1997.

h）周长发,苏翠荣,归鸿.中国蜉蝣概述[M].科学出版社,2015.

D.4 软体动物门：

刘月英.中国经济动物志:淡水软体动物[M].北京:科学出版社,1979.

附录2

底栖动物样品分析记录表

采集地点：                                                                             定性/定量：

采样工具：                               采集工具面积：                                采集次数：

鉴定人员：                                                                             固定剂：

附录3

底栖动物样品固定和保存的方法

1、麻醉。常用的麻醉方法有以下几种：用1%的乙醚麻醉各种动物；将薄荷脑磨成粉撒在培养液中；将硫酸镁饱和溶液放入培养液中；配置70%的乙醇溶液慢慢滴入培养液中。

2、刺胞动物样品。先将样品静置于盛有清水的容器中，向容器中轻慢地撒入（或滴入）麻醉剂，直至样品完全麻醉、不再收缩。再向容器中加入甲醛溶液固定（终浓度约10%），再将固定后的样品移入5%甲醛溶液保存。

3、扁形动物（涡虫）样品。先将样品静置于盛有清水的培养皿中（90 mm），待虫体伸展后，加入适量薄荷脑麻醉3~4 h，待虫体完全舒展、不再收缩以后，再移入75%乙醇溶液固定和保存。

4、环节动物与线形动物样品。

4.1 一般可用10%甲醛溶液固定24 h后，再用5%~7%甲醛溶液保存。

4.2 寡毛类样品。先将样品麻醉，使其身体舒展后再进行固定。常用的麻醉方法是：将虫体放入培养皿中，加入少量清水（约10 mL）。然后，每隔10 min用滴管滴加95%乙醇（2~3滴），直至终浓度变为10%（约滴加10~12 次），直至虫体全部伸直（约用时2 h）。固定1~2 d后，再将样品移入75%乙醇溶液保存。部分水栖寡毛类样品因鉴定工作的需要，可以制作成甘油封片或整体装片进行保存。

4.3 蛭类和多毛类样品。可以先麻醉再固定，使其身体适度伸展、不扭曲。常用的麻醉方法有以下两种。方法一：在标本瓶中加入1/3容积的10％乙醇，放入活体标本；盖好瓶盖后，用力振荡3~5 min，使标本充分伸展；然后将标本取出，用手指轻轻拭去粘液，将标本平铺 在一干底的盘内，使标本挺直；加入上述固定液，即可得到自然伸展的标本。方法二：采用具有麻醉和固定双重作用的试剂，即将标本放入广口瓶中，加入98 mL的水、再加入2 mL甲醛溶液（40%），通入二氧化碳，使之呈过饱和状态；然后紧闭瓶口，使标本伸展。待标本完全伸展后移至50%乙醇溶液中固定。待标本完全变硬后，再移至75%乙醇溶液中保存。多毛类如沙蚕样品，可先将样品麻醉，然后用10%甲醛溶液固定，固定时可使用镊子轻压 体前端，将沙蚕吻部挤压出来（以便于物种鉴定），固定24 h后移入5%～7%甲醛溶液保存。

4.4 若蛭类标本的眼点不清晰，可使用5%氢氧化钾溶液浸泡和漂洗头部。

5、软体动物样品。麻醉后，用75%乙醇溶液固定。2～5天后，更换一次75%乙醇溶液。一些小动物不易麻醉的可直接用75%乙醇固定和保存。

6、节肢动物样品。

6.1 甲壳动物样品。先使用70%乙醇麻醉样品，以防止肢体脱落，然后再将样品置于75%乙醇溶液中固定、保存。

6.2 水生昆虫样品。体型较大的幼虫可使用福尔马林－乙醇－冰醋酸混合液（比例为5：15：1）固定和保存。其他幼虫样品，可将虫体放入75%的乙醇溶液固定和保存。

7、体型较小的动物样品。可采用硼砂洋红染色和二甲苯透明封片的方法进行标本处理。